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高国政 颜锦1
(信阳215011普强信阳造药有限公司;1信阳215011信阳中化药品工业有限公司)
提要
主张:钻研样品pH对细菌内毒素测定的影响。
步骤:利用动态浊度法定量测定样品中细菌内毒素的含量;由细菌内毒素参考尺度品(RSE)造成两种浓度的稀释液,在14个pH量级上,与国内表两种MG游戏官网(TAL,LAL)反映;观察每组均匀回收率。
了局:pH梯度上,两种MG游戏官网回收曲线都出现三个反映顶峰,别离为pH 5.20,pH 7.83/pH6.23和pH10.55。样品pH在6～ 8间尝试了局不变,4λ阳性对照的均匀回收率为76.5%～ 115.9%和85.8%～ 99.8%;当样品pH值≤ 3或≥ 12时,细菌内毒素试验受到抑造,均匀回收率≤ 56.8%。
结论:细菌内毒素试验中应该调节检品pH;使用TAL时,检品pH应预调在(6.5～ 7.5)为好;使用LAL时,检品pH应预调在(6.2± 0.1)或(6.7～ 7.8)为好。
关键词 细菌内毒素;pH;MG游戏官网(TAL,LAL);动态浊度法
细菌内毒素(endotoxin)重要存在于革兰阴性菌细胞壁的最表层,当细菌殒命、裂解后才会开释出来。其化学成分是磷脂-多糖-蛋白质复合物,重要成分为脂多糖(lipopolysa-charide,LPS),临床上可引起发热、微循环阻碍、内毒素休克、DIC等症状[1]。在造药工业中,细菌内毒素被以为是药品热原(pyrogen)的性质[2～ 3]。作为代替家兔热原试验的细菌内毒素试验已被多国药典收载。目前,美国药品食品治理局(FDA)认可3种使用MG游戏官网检测细菌内毒素含量的步骤,即凝胶(gel-clot)法、生色(chromogenic)法和动态浊度(kenitic-turbidimetry)法。中国药典(1995年版)只选取凝胶法。我们利用动态浊度法,定量测定样品中细菌内毒素,并同时使用了东方鲎细胞裂解物(tachypleus amebocyte lysate,TAL)和美洲鲎细胞裂解物(limulus amebocyte lysate,LAL)两种MG游戏官网,以索求在细菌内毒素试验中,检品pH对测试影响的水平。
1 资料和步骤
1.1 试剂和仪器
美国药典细菌内毒素参考尺度品(RSE),10 000 EU·瓶- 1;TAL(乐山MG游戏官网厂,批号960118,活络度0.125 EU·ml- 1,1 ml·瓶- 1;LAL(活络度0.125 EU·ml- 1,5.2 ml·瓶- 1;LAL溶化水批号4M0757,内毒素含量≤ 0.005 EU·ml- 1,pH 6.23);细菌内毒素测定仪;206型pH计;超净工作台。
1.2 样品处置
氢氧化钠(AR)经185℃ ,4 h烘烤,配造成鼓和溶液。浓盐酸(AR)不经处置。按中国药典(1995年版)附录XV F步骤,配造成0.1 mol·L- 1的NaOH和HCl溶液,121 ℃灭菌3 h。配造中所用器材都除热原。用新鲜灭菌注射用水(WFI,pH 5.61,内毒素含量 0.03 EU·ml- 1)作稀释液。0.1 mol·L- 1盐酸陆续4次10倍量稀释,0.1 mol·L- 1NaOH溶液陆续6次10倍量稀释,并选取LAL溶化水(pH6.23)和WFI(pH 5.61)造成14个量级的梯度pH溶液,别离参与RSE造成含细菌内毒素0.5 EU·ml- 1和0.125 EU·ml- 1的样品。
1.3 测定道理和步骤
肯定量的细菌内毒素和MG游戏官网在37℃孵化时,混合物的浊度随功夫而变动,在反映进行一半(t50)时,混合物浊度的变动速度最快。细菌内毒素测定仪可自动测定各浓度值下的t50,经分析推算后绘造尺度曲线,测定步骤见表1。阴性对照、阳性对照、空缺对照同时立时,测定了局有效。异常值的舍弃凭据Smirmoffsl法(n= 4,α0.01= 1.493)。
1.4 尺度曲线
1.4.1 LAL尺度曲线 按USP划定步骤使用RSE,配造稀释液组,尺度曲线方程为lg t=0.960 0- 0.386 0 lg c,r= - 0.998 8(n= 4),线性领域0.031 3 EU·ml- 1～ 10.012 8 EU·ml- 1,λ= 0.031 3 EU·ml- 1。
1.4.2 TAL尺度曲线 尺度曲线方程为lg t= 3.143 2- 0.386 8 lg c,r= - 0.997 9(n=4),线性领域0.125 3 EU·ml- 1～ 10.816 4 EU·ml- 1,λ= 0.125 3 EU·ml- 1。
2 结 果
2.1 试验分成3组,每组有14个样品,其pH递增。第1组加样品0.2 ml(含0.5 EU·ml- 1RSE)和TAL 0.1 ml,该样品中RSE浓度为4λ。第2组加样品0.2 ml(含0.5 EU·ml- 1RSE)和LAL 0.1 ml。第3组加样品0.2 ml(含0.125 EU·ml- 1RSE)和LAL 0.1 ml,该样品中RSE浓度也为4λ。凭据各样品的t50,推算回收了局,见表2。pH在4～ 11之间,RSD为1.16%～ 12.29%,s为0.005 0～ 0.054 6,尝试的精密度较好。本尝试了局发现,两种MG游戏官网(TAL,LAL)在pH 5.20,pH 7.83/pH6.23和pH 10.55处均有凝聚顶峰,当pH≤ 3或pH≥ 12时,细菌内毒素试验受到显著抑造(均匀回收率≤ 56.8%),见图1。两种MG游戏官网在pH梯度上的回收有差距,但在pH6～ 8间,回收曲线不变。
2.2 以pH梯度为横轴,绘造质控图。图中可见几何均匀值( x)、最大值和最幼值,可同时观察试验的正确度和精密度。凭据FDA划定,4λ阳性对照的回收应在尺度曲线± 25%以内[2],此处判断动态浊度法检验有效的尺度是均匀回收率达到(100± 20)%,相应的借鉴线为(100±10.7)%。因而,对TAL允许丈量值为(0.5±0.1)EU·ml- 1,借鉴值为(0.5± 0.053 3)EU·ml- 1,见图2。图中显示:TAL尝试的最佳pH为6.68～ 7.12,此时正确度和精密度较为中意,在pH 6.23和pH 7.83均有丈量值逸出允许领域。对LAL允许丈量值为(0.125±0.025)EU·ml- 1,借鉴值为(0.125± 0.013 3)EU·ml- 1,见图3。图中显示:LAL尝试的pH值在6～ 8都满足试验的要求,在pH 6.23处,反映可获得较佳回收,在pH6.68～ 7.83时,回收较为不变。
2.3 反映实现后(t> 4200 s),用pH试纸测定反映混合物pH值,了局见表3。
2.4 观察酸碱对内毒素的粉碎作用 0.1 mol·L- 1HCl溶液参与RSE,配成含细菌内毒素1EU·ml- 1的溶液,常温搁置3 h,加等量0.1 mol·L- 1NaOH溶液中和后,测得浓度幼于0.031 3EU·ml- 1。同法做碱处置组,其测定值为0.533 3 EU·ml- 1(均匀回收率为106.7%,RSD= 7.3%,n= 4)。了局批注:常温下强酸液(pH 1)对内毒素有较强的粉碎作用,而强碱(pH 13)则无。关于酸或碱对内毒素的灭活还须进一步钻研。
3 讨 论
3.1 鲎血细胞溶化物中的凝固酶原,可能被微量的细菌内毒素激活天生凝固酶,促使可凝蛋白向凝固蛋白转化,最终形成凝胶样物质,这是一个极复杂的链式酶原反映[4]。该反映极其活络,凝胶形成速度与内毒素浓度成正比,并受温度、反映物中Ca2+/Mg2+离子浓度和pH等成分的影响[4～ 5],温度和pH值的差距直接会影响到多种因子和蛋白质的活性,影响可凝蛋白的转化和凝胶的形成,引起了局的差距。
3.2 在细菌内毒素试验中，对于样品PH问题，《美国药典XX版》划定PH在6-7.5之间，美国药典XXⅢ版中此项划定放宽至PH6-8[6~8]，英国药典（1993年版）划定为PH6.5~7.5[5]。中国药典(1995年版)对此未作具体划定。凭据国内表资料的报路,试验的最适pH在6～ 7.5,6.25～7.25或6～7等,这些结论多是以凝胶法中凝胶强度的轻微差距来判断,存在较大的主观差距,国内也有报路以为大输液不用调pH值。我们以为pH的调节是必要的,即便样品pH在6～8之间,仍存在法规性的变动,因而分歧次的测定中,应调节检品pH值,尽量与尺度曲线造作(或MG游戏官网活络度复核)时的pH相一致。
3.3 我们利用动态浊度法,仪器和操作者资格均经过验证。本法使用0.2 ml的样品和0.1ml的MG游戏官网反映,样品使用量比凝胶法大,因而两种测试步骤中pH对细菌内毒素测定的影响可能不齐全一样,但从混合物最终pH来看(表3),MG游戏官网自身拥有肯定的缓冲能力。当样品pH在5.20～ 9.17时,用pH试纸测得混合物pH根基为7,在这个领域内,动态浊度法仍显示了分歧pH对测定了局有较大影响,其原因可能是混合物最终pH的轻微差距会较大水平地影响凝胶的形成,但也不排除样品pH对MG游戏官网中活性成分的影响,从这个角度讲,在pH问题上,两种测试步骤是一致的。
3.4 细菌内毒素试验用于临床细菌内毒素血症(endotoxemia)和注射剂如粉针、水针及生物制品的测试时,由于这些检品自身拥有肯定的缓冲能力,当其pH越偏离6～ 8之间时,对细菌内毒素测定的影响也会越大。
参考文件（略）
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